TINCIÓN DE PERLS

PROTOCOLO PRÁCTICO:  

TINCIÓN DE PERLS

Fundamento

    Los denominados cuerpos de Pappenheimer son partículas de hemosiderina unidas a material proteico. Aunque la hemosiderina no se tiñe con los colorantes panópticos, sí lo hace el material proteico al que se ha unido y con ello permite que estos acúmulos de hemosiderina se vean con las tinciones panópticas. Aparecen de color azul negruzco y se asocian a estados de exceso de hierro.

    Los siderocitos son hematíes que contienen uno o más gránulos de hemosiderina (gránulos sideróticos). Estos gránulos no se ven en los frotis teñidos con tinciones panópticas. Para observarlos es necesario realizar la tinción de Perls, con la que se tiñen de color azul turquesa.

 

Material necesario

          * Microscopio óptico.

    

          * Tubos de hemólisis. 

      

          * Pipetas Pasteur. 

          * Portas esmerilados

                

          * Sistema de filtración

Miembros de la Clase de Hematología,

preparando el reactivo de Azul de Prusia.

Reactivos

     *  Agua destilada (H₂O).

       *   Metanol (CH₄O).

               

       *  Colorantes:

• Azul de Prusia. Formado por:

                    a)      Acido Clorhídrico (HCl) al 0,2N.

                    b)      Ferricianuro Potásico (K₃[Fe(CN)₆]) al 5%.

• Safranina: al 0,1 % en solución acuosa (colorante de contraste). Se puede sustituir por eosina.

Técnica

          1º.   Preparación del colorante Azul de Prusia**:

               1.2. Hacer una solución de Ácido Clorhídrico (HCl) al  0,2 N.

               1.3. Pesar 5 g de ferricianuro potásico (K₃[Fe(CN)₆]). 

              1.4. Disolver en 100 ml de agua destilada (H₂O), el ferricianuro                                preparado anteriormente.

              1.5.Mezclar al 50% la solución de HCl 0,2 N y la de ferrocianuro                          potásico, obteniendose así el reactivo al completo.

Miembros de la Clase de Hematología, 

en una explicación de la preparación 

del reactivo de Azul de Prusia

        ** El reactivo Azul de Prusia completo, una vez mezclado  y preparado,             es una solución extemporánea; por ello  se debe mezclar justo 
            antes  de su uso y filtrarlo para evitar 
            precipitados.         

      2º. Tinción de los eritrocitos: 

        2.1. Realizamos dos extensiones y las dejamos secar al aire.

        2.2. Colocamos las extensiones en las parrillas de tinción 
               y fijamos las extensiones con metanol (CH₄O) durante 
               10 minutos.

     

            (También se puede hacer en  cubetas de Coplin colocando 
             los portas en sus cestillos correspondientes).

       2.3.   Lavamos con agua destilada (H₂O) y escurrimos.

      2.4. Teñir con el Azul de Prusia durante 20 minutos.

Compañeras tiñendo sus frotis con el

reactivo de Azul de Prusia

Frotis teñidos con Azul de Prusia

     2.5. Lavar con abundantes agua destilada y escurrir bien, 

            dejando secar un poco.

     2.6.  Teñir con safranina al 0,1 %  durante 5  minutos.

Compañera tiñiendo frotis con Safranina

 

Frotis teñidos con safranina

   2.7.   Lavar con abundante agua destilada y dejar secar al aire.

   2.8.  Observar la extensión al menos 10 campos.

  2.9.  Si existen siderocitos se hace el recuento  igual que en uno 
         realizado para  los reticulocitos.

Interpretación

    - Los cuerpos de Pappenheimer  en condiciones normales pueden
      observarse entre un 0,5 -0,8 %.

    - Los siderocitos son característicos de las anemias sideroblásticas y 
      de personas  esplenectomizadas.

VSG

VELOCIDAD DE SEDIMENTACION GLOBULAR 

          “Velocidad a la que sedimentan las células sanguíneas, especialmente 

           los hematíes, de una muestra de sangre anticoagulada”. 

Principio

Cuando se coloca sangre venosa anticoagulada en un tubo vertical y se deja en reposo, los eritrocitos tienden a caer hacia la par­te inferior (sedimentan).

La velocidad de sedimentación globular (VSG) es equivalente a la longitud del recorrido descendente de eritrocitos, en un inter­valo determinado de tiempo (mm / hora).

                

 Fases de la VSG

Se pueden observar tres fases:

1) Agregación. Los hematíes se aglutinan entre si, formando 

     agregados a modo de pilas de monedas. Tiene lugar en los primeros 10              minutos. Se forman las pilas y hay poca sedimentación.

2) Sedimentación de los agregados formados. La sedimentación se 

   pro­duce a una velocidad más o menos constante. Tiene lugar  du­rante  40          minutos  siguientes aproximadamente.

3) Acumulación. Es la fase de concentración de las células en el fondo. 

    La sedimentación  se ralentiza nuevamente. Tiene lugar en los  siguientes  

    10 minutos, a medida que las células se apilan en la parte inferior del tubo.

Factores contribuyen a la V.S.G. 

A - Factores plasmáticos:

-Los niveles elevados de fibrinógeno y, en menos medida de gammaglobulinas favorecen una VSG acelerada. Disminuyen la carga negativa de los eritrocitos(potencial zeta) que tienden a mantenerlos apartados. La disminución de este potencial promueve la formación de apilamientos, que sedimentan más rápidamente que las células aisladas.

– La albúmina aumenta el potencial Z, tiende a mantener los hematíes    separados, por lo que disminuye la VSG.

– En condiciones normales, hay un equilibrio entre el efecto de la albumina y  las restantes proteínas plasmáticas.

B - Factores eritrocitarios:

* La anemia es responsable de una mayor VSG, ya que la variación de la            relación eritrocito-plasma favorece la for­mación de apilamientos.

* La velocidad de sedimentación es directamente proporcional al peso del agregado celular e inversamente proporcional al áreal superficial.

* Los microcitos se sedimentan con mayor lentitud que los macrocitos, que tienen un área superficial disminuida en relación con el volumen.

* Los hematíes con forma anormal o irregular, tales como las células falciformes o los esferocitos, dificultan la formación de pilas y disminuyen la VSG.

MÉTODOS

(video)

MANUALES

A ) Método de Westergren. Este método se utiliza mucho debido a su sencillez. Es el más antiguo y sigue siendo de referencia para el resto de los métodos. El Nacional Committee for Clinical Laboratory Standards lo ha recomendado como base de un método estandarizado aceptable.

   Equipo. El tubo de Westergren es una pipeta recta de 30 cm de longitud y un diámetro interno de 2,5 mm. Está calibrad o en milímetros de 0 a 200. Tiene un volumen aproximado de 1 ml. También se utiliza la gradilla de Westergren.

  Reactivo. Como solución de diluyente-anticoagulante se utiliza una solución 0,105 M de citrato sódico.

Tecnica:

1.Se añaden 4 ml de sangre total a 1 ml de citrato sódico y se mezclan por inversión.

2. Se llena una pipeta de Westergren hasta la señal 0 y se coloca verticalmente en el portapipetas, a temperatura ambiente, sin vibración ni exposición directa a la luz del sol.

3. Después de 60 min exactos, se registran en milímetros la distancia al extremo superior de la columna de eritrocitos como valor de VSG.

B ) Método micro VSG. Método similar al de Westergren, utilizando 0,2 ml de sangre para llenar un tubo de un solo uso de plástico de 230 mm de longitud y 1 mm de luz interna.

Este método se puede mostrar especialmente útil en enfermos pediátricos.

Los valores de referencia de la técnica de Westergren son los siguientes:

ALTERACIONES

 Causas de error

§) El valor de la VSG puede estar elevado si la concentración del anticoagulante es mayor de lo recomendado.

§) La heparina altera el potencial zeta de la membrana y no puede utilizarse como anticoagulante en esta prueba.

§) La presencia de burbujas en el tubo, cuando se llena, afectará la VSG.

§) La hemólisis puede modificar la sedimentación. 

§) La inclinación del tubo acelera la VSG. Una desviación de sólo 3% a partir de la vertical puede acelerar el valor de la VSG en hasta un 30%. 

§) La temperatura debería mantenerse entre 20-25ºC, ya que, las temperaturas inferiores o superiores en algunos casos alteran la VSG. Si la sangre se ha guardado refrigerada, se debería llevar a temperatura ambiente antes de realizar la prueba.

§) La prueba debería prepararse 2 horas después de haber obtenido la muestra de sangre; de lo contrario, algunas muestras con VSG elevada dan valores falsamente bajos.

§) No hay un método efectivo de corrección para la anemia en el método de Westergren.

AUTOMATICOS: mediante autoanalizadores 

Interpretación 

* La VSG es una prueba sensible, pero muy inespecífica. Su elevación no es indicador de una enfermedad concreta y una VSG normal, no excluye una enfermedad. Una vez diagnosticada una enfermedad la VSG es útil en su seguimiento, no se considera la curación hasta obtener una VSG normal.

*En el embarazo el valor de la VSG aumenta  moderadamente; dicho aumento empieza entre la 10 y 12 semanas de gestación. Las velocidades se normalizan aproximadamente un mes después del parto.

*La VSG tiende a elevarse notablemente en los trastornos de las proteínas sanguíneas.


*Incrementos moderados resultan corrientes en los casos de enfermedad inflamatoria activa.

PRACTICA:

Nuestro compañero Antonio con los 

materiales necesarios para la práctica

Según protocolo comercial.

FROTIS SANGUÍNEO

PROTOCOLO: FROTIS SANGUÍNEO 

Concepto 

 La extensión sanguínea o frotis es una fina película de sangre extendida sobre un porta, de tal manera que las células estén dispuestas en una sola capa.

 Se utiliza para la observación de las células sanguíneas, para lo cual, tras la extensión de la muestra, se procede a su fijación y tinción.

 Si queremos estudiar la morfología en células vivas se pueden usar colorantes vitales. Se trata de colorantes capaces de fijarse a los distintos componentes celulares sin destruir la célula de forma inmediata. Se usan muy diluidos para disminuir su acción tóxica, aumentando así el tiempo que las células pueden ser observadas vivas.

 Los colorantes vitales más conocidos son el rojo neutro, el azul de metileno, el azul de cresil brillante, el azul tripán y el verde Janus.

Material 

* Dos portaobjetos esmerilados bien limpios y desengrasados (en            alcohol-acetona al 50%).

* Una pipeta de Pasteur desechable.

Técnica

           

1º Coger una pequeña cantidad de sangre del tubo con una pipeta de        Pasteur y depositarla en un extremo del porta.

2º Colocar otro portaobjetos sobre el primero con un ángulo de unos  45º desplazándolo hasta que contacte con la gota de sangre.

3º Dejar que por capilaridad se extienda la gota de sangre por el borde  del portaobjetos.

4º Arrastrar este porta de manera suave y rápida sobre el primer              portaobjetos de manera que la gota de sangre se extienda uniformemente.

5º Dejar secar el porta al aire y rotular con lápiz en la banda mate el  nº de muestra.
     El grosor de la extensión varía en función del tamaño de la gota de      sangre y del ángulo que forman los dos portaobjetos. 
Un ángulo mayor de 45º aumenta el grosor y la extensión queda más corta.

Un ángulo menor de 45º disminuye el grosor quedando la extensión más fina y larga.

Una extensión correctamente realizada debe presentar tres zonas:

a)Cabeza: zona inicial. Los hematíes pueden estar formando más de una capa.

b)Cuerpo: los hematíes se disponen formando una sola capa en una proporción equilibrada. Es la zona ideal para el estudio celular.

c)Cola: es la zona final. Las células se disponen de forma acordonada dejando huecos entre ellas. La cola termina de forma deshilachada (barbas).

Extensiones defectuosas

a) extensiones en las que se ha puesto una gota muy grande. Se llega al final del porta sin que la gota haya sido extendida, no dando lugar a que se formen las barbas.

b) extensiones en las que el porta se levanta antes de acabar de hacer  la extensión. No se forma la cola.

c) extensiones con zonas agujereadas debido a la presencia de grasa en los portaobjetos por falta de limpieza.

d) extensiones en las que los bordes coinciden con los del porta por haber esperado que la gota por capilaridad se extendiera por todo el borde del porta extensor.

e) extensiones con alternancia de zonas gruesas y finas que le dan           aspecto de persiana. Se producen cuando la velocidad de                   deslizamiento no ha sido homogénea.